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Tipos de microscopía (2) (Fundamentos de biología celular)

el anterior artículo de tipos de microscopía intenté hacerlo sencillo para que la gente lo comprendiera bien, y esto me hizo recibir un punto negativo, así que he hecho una segunda parte más completa, para aquellos estudiantes que  lo necesiten.

Microscopio optico compuesto (Microscopio optico de campo claro)

Distancia focal: Es la distancia entre el punto medio de la lente y el foco en el que convergen los rayos que atraviesan la lente

Apertura angular: Es la mitad del angulo del cono de luz (2?) que entra en el objetivo del microscopio a partir de la muestra

Es una medida de la cantidad de iluminacion que sale de la muestra y pasa a traves de la lente

En los mejores microscopios opticos la apertura angular es de 70º

Resolucion: El limite de resolucion o resolucion de un microscopio es la distancia minima a la que pueden estar dos puntos contiguos del objeto observado, de manera que se puedan distinguir como puntos diferentes

LR = 0.61 ? / N

      N = n sen ? (apertura numerica)

      ? = longitud de onda de la luz, en el vacio, que ilumina la        muestra

      n = indice de refraccion del medio en que esta la muestra

     (n = velocidad de la luz en el vacio/ velocidad de la luz en el medio)

      ? = la mitad del cono de luz que entra en la lente objetivo

      0.61 = constante

 

Microscopia optica: tipos de microscopios

- Microscopio de campo claro (ya lo hemos visto)

- Microscopio de campo oscuro

Recorrido de la luz desde el condensador a la lente objetivo en un microscopio de campo oscuro:

Un disco opaco bloquea la region central del condensador de manera que los rayos transmitidos a traves de la muestra sin dispersion no pueden entrar directamente en el objetivo

Solo los rayos refractados o difractados contribuyen a la formacion de la imagen

Los puntos de la muestra que dispersan la luz en el objetivo aparecen brillantes en un fondo oscuro

La luz se dirige desde el condensador a la muestra en un

angulo oblicuo, por lo que ninguna luz incidente entra en las  lentes objetivo (creando un campo oscuro si la muestra no está presente)

Solo la luz refractada (desviada) o difractada (dispersa) por la muestra entra en el objetivo para formar la imagen

La resolucion no es muy buena, pero se pueden visualizar pequeños objetos que refractan una gran parte de la luz incidente y que aparecen como brillantes gotas de lluvia en un rayo de sol

Se usa en microbiologia, para detectar pequenas celulas, y enautorradiografia, para detectar granulos de plata

- Microscopios de contraste de fase y Microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC o Nomarski)

Para visualizar células vivas

convierten pequeñas diferencias de índice de refracción o grosor entre partes de una muestra o entre una muestra y el medio que la rodea en diferencias de luz y oscuridad en la imagen final

La luz se mueve más lentamente en medios con mayor índice de refracción. como consecuencia, parte de una onda luminosa que pasa a través de una muestra será refractada o difractada y estará fuera de fase con la parte de la onda que no pasa a través de la muestra

Lo que difieren sus fases depende del índice de refracción a lo largo de las dos vías, y del grosor de la muestra

si las dos partes de la onda luminosa se recombinan, la luz será más brillante si están en fase y menos si están fuera de fase.

En el microscopio de contraste de fase, una placa de fase de vidrio (anillo de fase) entre la muestra y el observador incrementa las diferencias de contraste

La luz incidente pasa a través de un diafragma anular que enfoca un anillo circular de luz sobre la muestra.

La luz que pasa sin obstáculo a través de la muestra es enfocada por la lente objetivo en el anillo gris grueso de la placa de fase, que absorbe la luz directa y altera su fase en un cuarto de longitud de onda.

si la muestra refracta o difracta la luz, sin embargo, la fase de algunas ondas luminosas es alterada y son redirigidas a través de la región clara, delgada, de la placa de fase antes de la recombinación con las ondas  de luz no refractada.

Esto produce una imagen en la cual el grado de oscuridad oclaridad de una región de la muestra depende del índice de refracción de esa región.

- Microscopio de contraste de fases

Para examinar muestras vivas y sin teñir ya que los materiales biológicos producen difracción de la luz de manera casi inevitable

se emplea en microbiología y en investigación con cultivos celulares para detectar bacterias, orgánulos celulares y otras pequeñas partículas presentes en las muestras vivas.

- Microcopio DIC

utiliza luz polarizada en un plano

el polarizador y el primer prisma de wollaston separan el rayo de luz, creando dos haces separados por una pequeña distancia Despues de atravesar la muestra, los haces se recombinan por el segundo prisma de W.

Si no existe muestra, los haces se recombinan para formar un rayo identico al que entro inicialmente en el polarizador y en el primer prisma de W.

 

En presencia de una muestra, los dos haces interfieren entre ellos, y la polarizacion de los haces rota ligeramente en comparacion con el original y pasa por el analizador que esta rotado 90º respecto al analizador

 

Diminutas diferencias en grosor o indice de refraccion entre partes adyacentes de una muestra se convierten en imagenes brillantes (si los dos rayos estan en fase) u oscuras (si estan fuera de fase)

 

 

- Microscopio de fluorescencia

Permite detectar la presencia de moleculas o iones fluorescentes dentro de la celula

La luz procedente de la fuente de iluminacion pasa a traves de un filtro de excitacion (primer filtro de corte) que transmite solo luz de una longitud de onda particular

El condensador enfoca la luz sobre la muestra, haciendo que los compuestos fluorescentes emitan luz de una longitud de onda mayor

Posteriormente, el filtro barrera (segundo filtro de corte) elimina la luz de excitacion y permite el paso de la luz emitida

La imagen se forma exclusivamente a partir de luz emitida por moleculas fluorescentes de la muestra

 

- Microscopio de barrido confocal de fluorescencia

Microscopio optico que emplea un haz laser para iluminar un solo plano delgado o “corte optico” dentro de la muestra, en un momento dado

Los fluorocromos absorben luz incidente de longitud de onda corta y la emiten de nuevo en un longitud de onda mayor

La luz emitida por la muestra se enfoca en un sitio al interior del microscopio que contiene una abertura puntiforme

Por tanto, la abertura y el plano iluminado son confocales

Los rayo de luz emitidos por el plano iluminado de la muestra pueden pasar por la abertura, mientras que el paso de cualquier otro rayo que pudiera emanar de un plano superior o inferior al plano determinado se impide para que no participe en la formacion de imagen

Los puntos fuera del foco de la muestra se tornan invisibles

 

- Elementos Microscopio de barrido láser confocal

Laser para iluminar un punto de la muestra en un determinado momento (lineas azules)

Los espejos de barrido mueven el punto en un determinado plano de foco siguiendo un patron preciso

La luz fluorescente emitida por la muestra (lineas rojas) es reflejada por los mismos espejos de barrido y retorna por el mismo recorrido inicial del haz incidente

La luz emitida no vuelve al laser y, por el contrario, es transmitida a traves de un espejo dicroico (que en este ejemplo refleja la luz azul y transmite la roja)

Un orificio o pinhole en el plano de la imagen bloquea los rayos extraños que estan fuera de foco

La luz es detectada por un tubo fotomultiplicador, cuya senal es digitalizada y almacenada en un ordenador

 

Microscopia electronica

Fundamentos de microscopia electronica de transmision(MET)

En microscopia electronica, la fuente de iluminacion son electrones que llevan asociada una onda de muy pequena longitud de onda que permite una mejora considerable del limite de resolucion en relacion con el microscopio optico

Todo el espacio atravesado por los electrones debe estar en alto vacio (10-7 milibares) para que los electrones no se dispersen y sean absorbidos por moleculas de aire

Las muestras deben estar secas y no ser volatiles

El haz de electrones atraviesa la muestra y es enfocado por campos electrostaticos y magneticos para producir una imagen

Los campos magneticos son generados por corrientes electricas que pasan por espirales metalicas o bobinas

Una “pieza polar” de hierro situada en el eje de la bobina hace que el campo magnetico adopte la configuracion tridimensional necesaria

para enfocar los electrones

Los microscop. electronicos varian de foco cambiando la corriente de la lente

 

-      Elementos de un MET

Columna central que contiene:

1. Fuente de iluminacion o cañon de electrones (un filamento de

tungsteno y un anodo)

El filamento y su soporte se mantienen a un alto voltaje negativo

(-50.000 a – 100.000 voltios)

El anodo esta conectado a tierra y es positivo respecto al filamento

El filamento se calienta, por medio de una corriente electrica, a una

elevada temperatura que da lugar a la emision de electrones que

se desprenden de su superficie

Los electrones son atraidos por el anodo, acelerandose a una velocidad

que depende de la diferencia de potencial entre ambos

Con diferencia de potencial de -50.000 a – 100.000 voltios las ondas

asociadas a los electrones tiene una

? de 0.005 nm y LR = 0.7- 0.8 nm

? de 0.003 nm y LR = 0.5-0.6 nm

 

2. Lentes condensadoras

3. Lente objetivo

4. Lentes oculares (lentes intermedia y proyectora)

5.       a. Pantalla fluorescente o pelicula fotografica

b. Camara digital registra la pantalla

c. Detector digital detecta directamente los electrones

incidentes)

 

-      Lente magnetica

El campo magnetico, generado por una corriente que pasa a traves

de una bobina, toma una forma tridimensional por la pieza polar que

enfoca los electrones

La distancia focal de cada lente se puede incrementar o disminuir

variando la corriente electrica aplicada a la bobina

 

Microscopia electronica de barrido (MEB)

Revela la arquitectura de la superficie de las celulas y organulos

La corriente de electrones se enfoca en un punto de la superficie de la muestra por medio de un sistema de lentes electromagneticas condensadoras

El punto se mueve rapidamente (scan) sobre la superficie externa de la muestra mediante placas cargadas “deflectoras del haz o de corriente” situadas entre las lentes condensadoras y la muestra

El punto de luz excita moleculas a niveles altos de energia y emiten “electrones secundarios” que son recogidos por un “detector” localizado por encima y a un lado de la muestra generando una imagen de su superficie

El componente esencial del detector es un “detector de centelleo” que emite fotones cuando es excitado por los electrones que inciden sobre el

Los fotones generan una senal electronica sobre una pantalla de video

La señal hacia la pantalla de video esta sincronizada con el movimiento del haz de electrones primarios sobre la muestra por el circuito deflector (generador de barrido)

La imagen se genera entonces punto por punto, linea por linea en la pantalla al tiempo que el haz de electrones primarios va barriendo la muestra

La resolucion depende del tamano del spot o punto de iluminacion de electrones que barre la muestra 5-10 nm de diametro

Detector, lentes y muestra en vacio para evitar la dispersion y la absorcion de electrones secundarios

Muestra seca o que libere gas o agua tan lentamente que no altere

el vacio

 

 

Crio-Microscopia Electronica

Se congelan rapidamente mediante criofijacion las moleculas o agregados macromoleculares purificados

La congelacion rapida evita la formacion de cristales de hielo

Las moleculas quedan embebidas en hielo vitreo, agua congelada no cristalina que preserva mejor la estructura de las moleculas embebidas

La muestra se visualizan en un microscopio electronico a muy baja temperatura (-170o C)

A menudo, las muestras son rotadas y visualizadas desde numerosas orientaciones diferentes y se reconstruyen para proporcionar informacion tridimensional acerca de la muestra (tomografia electronica)

Microscopio de efecto tunel (STM)

no es un microscopio electrónica

Para explorar la estructura superficial de muestras a nivel atomico

Sonda con una punta muy afilada de un material conductor, como el platinoiridio, y compuesta por uno o unos pocos atomos

Se establece un voltaje electrico entre la punta y la superficie de la muestra a medida que la punta hace un barrido en las direcciones x e y

Se desplazan electrones a traves del espacio existente entre la punta y la superficie de la muestra (efecto tunel)

El flujo depende de la distancia y de pequeñas irregularidades en el tamaño de los atomos, que afectan a su velocidad

La sonda se mueve arriba y abajo (z) para mantener un flujo constante de electrones. Un ordenador mide ese movimiento y se representa en una pantalla de video

Difraccion de rayos X

Para analizar la estructura tridimensional de moleculas individuales

Reconstruye imagenes a partir de patrones de difraccion de rayos X que pasan a traves de una muestra cristalina o fibrosa

Los rayos X monocromaticos, de ? menor que la distancia entre atomos de la molecula; ? = 0.1 nm igual al diametro del atomo de hidrogeno

En el esquema, la onda A es desviada por un atomo en la capa superior de la red cristalina. La onda B es desviada por un atomo correspondiente de la segunda capa con el mismo angulo y direccion que la onda A, pero debe recorrer mayor distancia para alcanzar el atomo en la segunda capa

Dependiendo de la ?, del angulo de incidencia ?, y de la distancia d entre las capas de atomos del cristal, las ondas desviadas dejan el cristal en fase o fuera de fase

Si d es equivalente a una ?, los rayos desviados dejan el cristal mas o menos en fase y producen una un haz reflectante de mayor intensidad; si es equivalente a media ?, los rayos desviados dejan el cristal mas o menos fuera de fase, y se reduce la intensidad del rayo que sale

La crioEM y la cristalografia de rayos X se combinan para establecer un puente entre los niveles atomicos y molecular

Se combina una imagen de crioEM (a) de las subunidades ribosomales 30S y 50S y de un factor de liberacion RF2 con la estructura detallada de RF2 obtenida a partir de datos de rayos X (b) Se puede ver como la estructura de la proteina posibilita su encaje en la estructura general del ribosoma para desempeñar su funcion

 

 

enlaces relacionados:

Tipos de microscopía

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Comentarios:

  1. Escrito por anonimo
    Fecha: 2010-10-20 19:11:58

    Gracias por esta pagina, esta exelente

  2. Escrito por anonimo
    Fecha: 2010-10-20 19:15:57

    Exelente pagina, Gracias

  3. Escrito por Conidea
    Fecha: 2010-10-25 22:38:28

    hola amigas, me encanta que os haya servido, seguiré trabajando para que internet tenga una buena fuente de información, y que sea fiable, gracias.

  4. Escrito por anonimo
    Fecha: 2010-11-22 22:06:55

    una macana no se ve nada

  5. Escrito por Conidea
    Fecha: 2010-12-04 13:35:11

    bueno chico lo siento que no te haya servido, pero aunque se vean un poco borrosos los nombres de las imágenes, está explicado en el texto, así con estos apuntes saque una matricula en biologia celular, así que creo que están bastante bien los apuntes.

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