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Asimilación del Nitrógeno --> fisiología vegetal

De la misma forma que el CO2 , el N (NO3-) y el S (SO42-) se encuentran en un estado muy oxidado en la naturaleza por lo que tienen que ser reducidos por la planta para poderlo utilizar en forma de compuestos orgánicos (-NH2 y -SH en aminoácidos)

 Esto no ocurre con el resto de nutrientes que se recogen del suelo, que son utilizados con el mismo estado de oxidación con el que están en el medio.

 La fuente más importante de N es el NO3- aunque también es bastante importante el N en forma de NH4+, aunque la mayor parte de veces el N no se puede captar en esa forma debido a la presencia de bacterias nitrificantes que lo utilizan como donador de electrones en procesos de respiración anaerobia y lo oxidan hasta NO3-.

 La reducción del N por parte de las plantas es una reducción asimilidadora, ya que el N que se reduce es utilizado para la formación de compuestos orgánicos.

(La reducción no asimiladora del N la realizan bacterias con respiración anaerobia que utilizan el NO3- como aceptor de electrones).

 La reducción del N se puede producir tanto en la raíz como en el tallo. El sitio específico donde se produce de forma mayoritaria varía dependiendo de la especie vegetal y de las condiciones ambientales.

 El N se puede transportar, o bien en forma de NO3o, en forma de aminoácidos o amidas, pero nunca como NH4+, ya que éste es tóxico (es un inhibidor de la fosforilación oxidativa, tanto de fotosíntesis como de respiración).

 En general se transporta de una forma más o menos equitativa entre ambas formas, pero también se dan casos extremos en los que se transporta casi exclusivamente en forma de NO3- como en Baldano (95%) o en forma de aminoácidos o amidas como en el altramuz (90%).

 Viendo la actividad de la nitrato-reductasa en raíz y tallo se puede saber si el N se transporta en forma de NO3- (actividad alta de la nitrato-reductasa en tallo) o no (actividad alta en raíz).

 Que el transporte del N se realice de una forma u otra también depende de las condiciones ambientales, si la concentración de NO3- en el suelo es alta, la velocidad de entrada de éste va a ser muy grande, por lo que no va a dar tiempo a que se reduzca y se transportará de esa forma. Además, si el suelo está frío no se produce tampoco la reducción.

 

 

 Reducción o asimilación del NO3-:

 Comprende 2 etapas:

La primera consiste en la reducción del NO3- a NO2- en el citosol con gasto de NAD(P)H por medio de la nitrato-reductasa.

 

NO3- + NAD(P)H +H+                       NO2+ NAD(P) + H2O.

 

Los 2 electrones son para pasar el N de su estado de oxidación de +5 a +3.

 Hay 2 tipos de nitrato- reductasa

1-  la que utiliza NADH

2-  la que utiliza NADPH.

La forma más común en toda la planta es la que utiliza NADH, pero zonas de tejidos no verdes como las raíces, también puede existir la forma que utiliza NADPH.

La enzima nitrato-reductasa es un homodímero, es decir una enzima formada por 2 subunidades iguales, cada una de 100KDa y con 3 grupos prostéticos, que son FAD+, un grupo hemo, y un complejo con Mo (El Mo está unido a la enzima mediante una molécula orgánica denominada uterina que actúa como un quelatante del metal).

El mecanismo de acción de la enzima consiste en que el NADH cede sus electrones al FAD+, que se encuentra en el extremo carboxilo terminal de cada subunidad. De éste pasa al grupo hemo y de aquí al complejo con Mo (que está en el extremo amino terminal), el cual reduce al NO3-.

Cuando la planta tiene deficiencias en la nitrato reductasa, como puede ser un déficit de Mo, se producen síntomas como acumulación de NO3-.

          -Regulación de la nitrato reductasa: Existen 2 tipos de regulación de la nitrato reductasa:

          - una regulación lenta, a nivel de transcripción, por el NO3-

          - otro tipo de regulación rápida, a nivel post-transcripcional, por medio de la luz y los carbohidratos.

 

La nitrato reductasa es una enzima inducida por sustrato, es decir, el NO3- es un inductor de la síntesis de ésta enzima. En la gráfica 12.4 se expone un estudio que se realizó con plantas de cebada, en el que se experimentó viendo las concentraciones de ARNm de la nitrato reductasa y la actividad propia de la enzima frente a diferentes concentraciones de NO3-.

En este estudio se vio que hay un gran incremento de la concentración de ARNm de la nitrato reductasa en muy poco tiempo desde la exposición de la planta al NO3-.

La actividad de la enzima también aumenta con la exposición a NO3-, pero más lentamente que el incremento de la concentración de ARNm, ya que  existe un intervalo de tiempo desde la síntesis de éste hasta que la enzima esté funcional (tiene que salir al citoplasma, traducirse…).

Los carbohidratos y la luz regulan la actividad de la nitrato reductasa (regulación post-transcripcional).

La nitrato reductasa tiene un residuo de serina con un grupo -OH libre que es susceptible de ser fosforilado, cuando esto ocurre la enzima queda inactiva.

Así, cuando la irradiancia luminosa o la concentración de carbohidratos están a niveles elevados se produce la activación de la enzima, debido a que se activa una proteína fosfatasa que defosforila a la enzima, activándola.

En situaciones de oscuridad o de concentraciones altas de  Mg2+, se produce la activación de una kinasa que fosforila a los residuos de ser inactivando a la enzima.

La planta va a utilizar este tipo de regulación rápida o la otra regulación más lenta dependiendo de si su necesidad es instantánea o no.

La segunda etapa consiste en la reducción de NO2- a NH4+, mediante la enzima nitrito reductasa.

El NH4+ es la forma en la que se incorpora el N a la materia orgánica. Esta reducción tiene que ser muy rápida ya que el NO2- es un anión muy reactivo y muy tóxico.

Una vez reducido el NO3- a NO2-, se transporta del citosol a los cloroplastos en las hojas, ó, a plastidios si se produce en la raíz, donde se va a reducir hasta NH4+. La raíz y el tallo tienen diferentes isotipos de la enzima.

El NO2- se reduce a NH4+ mediante los electrones que cede una ferredoxina reducida (transferencia de 6 electrones). La ferredoxina reducida se obtiene en los cloroplastos del transporte electrónico de la fotosíntesis, mientras que en los plastidios de la raíz se obtiene a partir de NADPH que se produce en el ciclo de las pentosas fosfato oxidativo.

 

La nitrito reductasa está formada por un único polipéptido de 63 KDa que posee 2 grupos prostéticos, una agrupación de 4 átomos de Fe y otros 4 de S, y un grupo hemo.

 La ferredoxina reducida cede sus electrones a la agrupación de átomos de Fe-S, la cual los cede al grupo hemo, el cual va a cederlos al NO2- que se va a reducir a NH4+.

El gen de la nitrito reductasa se encuentra codificado en el núcleo. Al expresarse se va a sintetizar como un precursor junto con un péptido de tránsito para que lo reconozca el cloroplasto.

Esta enzima es inducida por NO3- y por la luz, mientras que los aminoácidos Asn y Gln reprimen su inducción.

 

          Fijación biológica del N:

Consiste en el proceso de formación de NH4+ a partir de N2 molecular por medio de microorganismos. A nivel cuantitativo la fijación de N2 por medio de los microorganismos supone unas 175 · 106 ton de N2/año.

La mayoría de microorganismos que fijan el N2 son bacterias de vida libre, pero hay algunas que son simbióticas de plantas y que ceden el N2 que fijan y que les sobra a cambio de productos fotosintéticos producidos por la planta.

Para las plantas también es beneficioso que existan en el suelo bacterias de vida libre que fijen N2 ya que éste termina siendo una fuente de nutrientes.

La fijación del N2 se produce en unas protuberancias que se forman en la raíz de las plantas que se denominan nódulos.

La asociación más conocida es la asociación entre plantas leguminosas y bacterias del género Rhizobium.

 

-Establecimiento de la simbiosis:

1º) Reconocimiento bacteria/planta: Para que se produzca el establecimiento de una relación simbiótica entre la planta y las bacterias fijadoras de N2 se necesita que haya un reconocimiento de una por la otra, pero para que haya reconocimiento debe haber una situación de déficit de Nen el suelo, ya que si la planta dispone de una provisión óptima de nitratos en el suelo no tiene porque formar simbiosis con la bacteria.

 El reconocimiento entre las bacterias de Rhizobium y la planta se produce por atrayantes químicos como isoflavonoides y betaínas secretas por la raíz. Estas sustancias atraen a la bacteria y hacen que se aproxime a la raíz de la planta.

Estas sustancias activan la proteína NOD de la bacteria, la cual va a activar a otras proteínas reguladoras nod que van a inducir la biosíntesis de los factores nod, moléculas señalizadoras de oligosacáridos tipo lipoquitina.

Estos oligosacáridos están formados por cadenas cortas de NAG que tienen unidos en su extremo no reductor ácidos grasos. Los factores nod se van a diferenciar según el número de C y de insaturaciones de sus ácidos grasos.

Estos liposacáridos son los compuestos que reconocen a la planta hospedadora, la cual va a reconocer a los factores nod mediante leptinas (receptores de azúcares) presentes en su pared celular.

 

2º) Organogénesis del nódulo:

El establecimiento del reconocimiento de la bacteria con la planta se realiza con una célula de pelo radical.

Tras el contacto de los factores nod con las leptinas y en respuesta a ellos, el pelo radical muestra un crecimiento curvilíneo anormal y sufre un rozamiento en el extremo.

Las bacterias van a entrar a la célula por ese extremo y van a generar un tubo de infección que va a ir creciendo a partir de la fusión de vesículas de Golgi a lo largo del pelo radical hasta llegar a la membrana basal de la célula con la cual se va a fusionar. Tras ello se produce una liberación de las bacterias a la célula subepidérmica en la cual se va a generar otro tubo de infección que se va a ir ramificando y entrando en varias células diana de la raíz.

En estas células las bacterias quedan en el apoplasto dentro de vesículas, rodeadas por la membrana peribacteroide, que puede englobar desde una a varias bacterias, se ha formado el simbiosoma.

Tras esto, las bacterias induce la división de las células de la raíz que va a conducir a la generación de protuberancias que son los nódulos.

Tras la formación de los nódulos ya se ha completado el establecimiento de la simbiosis y tras ello ya se puede empezar a fijar el N2 atmosférico.

El intercambio de N2 y de compuestos fotosintéticos entre la planta y la bacteria se va a producir a través de conexiones vasculares (de xilema y floema) que se forman con la bacteria.

 

-Fijación de N2:

La fijación de N2 la lleva acabo el complejo enzimático nitrogenasa.

Reacción global:

N+ 8 e- + 8 H+ + 16 ATP

2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi    

(los 8 e- son aportados por una ferredoxina)

La fijación de N2 es una reacción que gasta mucha energía y que además hace un malgasto de la energía que se gasta, ya que en ella se produce la formación de H2.

 Esto se produce debido a que el complejo nitrogenasa es relativamente poco específico por lo que puede utilizar como sustrato una gran cantidad de compuestos y reducirlos.

 El complejo enzimático nitrogenasa está formado por 6 subunidades organizadas en 2 subcomplejos.

-   Uno de ellos es la dinitrogenasa reductasa, que es una ferroproteína que contiene 4 átomos de Fe y 4 de S. Es sensible al O2.

-   El otro subcomplejo es la dinitrogensa y consiste en una Mo-Fe-proteína. Está formado por 4 subunidades. Cada molécula de dinitrogenasa tiene 2 átomos de Mo agrupados en 2 complejos denominados FeMo-co que están formados por Mo-Fe-S. Además poseen agrupaciones individuales de Fe-S. También se inactiva por O2.

 La secuencia de transporte de electrones para la reducción del N2 comienza con la donación de electrones de una ferredoxina reducida a la dinitrogenasa reductasa. Los electrones reducen a un átomo de Fe que le transfiere los electrones al Fe del complejo FeMo-co de la dinitrogenasa.

Tras esto, este complejo le cede los electrones al N2 que junto a la adición de 8 H+ reaccionan para formar 2 NH3 y un H2.

Como hemos dicho la nitrogenasa es un complejo que es sensible al O2, por ello todos los microorganismos deben evitar que el O2 dañe la enzima. La asociación simbiótica leguminosas-microorganismo ha desarrollado un mecanismo de defensa frente al O2 que es el pigmento LEG-hemoglobina, es un pigmento rojo que le da color rosado a los nódulos y que su función es captar el O2 y evitar que entre en contacto con la enzima.

 

 -Incorporación del NH4+ a la materia orgánica:

 Sea cual sea la forma de obtener el N ya sea por fijación mediante simbiosis con microorganismos, por asimilación de NO3- o de NH4+ directamente, el N se va a incorporar a la materia orgánica en forma de NH4+. Esta incorporación se tiene que realizar rápidamente ya que el NH4+ es muy tóxico.

 

La incorporación se realiza mediante 2 reacciones que se producen en secuencia:

-    Primero se genera gln a partir de glu, ATP y NH4+ (formándose ADP y Pi) mediante la enzima glutamina sintetasa.

-    Tras ello la gln va a reaccionar con 2-oxoglutarato mediante la glutamato sintasa (GOGAT, glutamina-2-oxoglutarato-N-sintasa) consumiendo NADH o una ferredoxina reducida como donador de electrones y obteniéndose 2 moléculas de glu. De esta forma ya se ha incorporado el NH4+ a la materia orgánica.

Como se requiere ATP se requiere un catión divalente como Mg2+.

 Existen 2 tipos de glutamina-sintetasa

-   una citosólica que forma gln para transportar N intracelularmente

-   una plastidial (en plastidios de raíz y cloroplastos de tallo) que genera el gln para consumo local de N o para incorporar el NH4+ fotorrespiratorio que se ha formado.

 

De la glutamato sintasa también existen 2 tipos

  1. que utiliza NADH, y que se encuentra en los plastidios de tejidos no fotosintéticos
  2. otra que utiliza Ferredoxina reducida, y que se encuentra en los cloroplastos de tallo.

 La actividad de la glutaminasintetasa está regulada por los niveles de luz y de hidratos de carbono. La glutamatosintasa está regulada en cantidad y actividad por los niveles de luz.

 Además de la vía llevada acabo por la glutaminasintetasa y la glutamatosintasa de incorporación del NH4+ a la materia orgánica, existen otras vías como la llevada a cabo por la glutamato deshidrogenasa.

 

Ésta, reacciona con 2-oxoglutarato generando glu y agua y utilizando NAD(P)H. Es una reacción reversible, y la vía favorecida es la descomposición del glu en vez de la de su formación, por lo que la reacción principal de formación de glu es la llevada a cabo por la glutamina sintetasa y la glutamato sintasa.

 De la glutamato deshidrogenasa también existen 2 tipos de enzima:

1-  la que utiliza NADH, que es mitocondrial

2-  la que utiliza NADPH, que es cloroplástica.

 Se dice que el NH4+ se incorpora a la materia orgánica al incorporarse a glu porque a partir de éste se pueden generar el resto de los 20 aminoácidos esenciales mediante reacciones de transaminación.

 Por ejemplo, el glu puede reaccionar junto con el oxalacetato mediante una aspartato transaminasa para dar asp y 2-oxoglutarato. O si reacciona con piruvato genera una alanina.

Las transaminasas y el glu se encuentran en casi todas las zonas de la célula, aunque la biosíntesisis mayoritaria de aminoácidos se produce en cloroplastos.

La formación de otro aminoácido, la asn mediante la asparragina sintetasa (AS) es muy importante para la planta. Se forma a partir de gln y asp produciendo asn y glu y se consume ATP dando AMP y PPi (que genera 2 Pi por la acción de una pirofosfatasa inorgánica).

La producción de asn es importante además de para la producción de proteínas, porque la asn es la forma principal de almacenaje y transporte de N.

Esto es debido a que la asn posee 2 átomos de N por 4 de C, es decir 1 por cada 2, lo que significa un almacenaje y un transporte de N más eficiente que mediante otros aminoácidos.

En condiciones de alta energía, de intensidad luminosa alta o de alta concentración de carbohidratos, se estimula la producción de glu. Mientras que en condiciones de baja energía se inhibe la producción de glutámico ( por glutamina-sintetasa y glutamato-sintasa) y se estimula la asparragina-sintetasa.      

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Comentarios:

  1. Escrito por anonimo
    Fecha: 2010-08-31 07:47:46

    Me parece muy impotante esta informacion ya que esta bien explicado el proceso de fijacion biologica del nitrogeno por los rhizobiun.

  2. Escrito por Conidea
    Fecha: 2010-09-20 23:02:32

    muchas gracias, si son los apuntes de clase de fisiologia vegetal, completados con otro punto de vista de microbiologia, dados por profesores de la universidad de Murcia, asi que espero que le sirvan a bastante gente, y me alegro que te hayan servido.

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